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1、測(cè)試細(xì)胞類(lèi)型
在選擇儀器之前，我們首先要思考兩個(gè)問(wèn)題：
1、自己的細(xì)胞房培養(yǎng)哪些細(xì)胞？
一般實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞房培養(yǎng)的大多為常規(guī)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系，比如腫瘤細(xì)胞、動(dòng)物哺乳細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等，這類(lèi)細(xì)胞直徑范圍在5-40μm。
還有一些可能是從組織或血液分離的原代細(xì)胞，比如脾細(xì)胞、PBMC細(xì)胞、臍帶血或骨髓源的原代間充質(zhì)干細(xì)胞等；這類(lèi)細(xì)胞組分復(fù)雜，可能有組織碎片、血小板、紅細(xì)胞等雜質(zhì)干擾 。
最后呢，還有一些老師在某些細(xì)分領(lǐng)域計(jì)數(shù)需求，比如酵母細(xì)胞（2-6μm）、T細(xì)胞（6-10μm)球藻細(xì)胞、芽孢桿菌等微生物小粒徑細(xì)胞（1-10μm），甚至低于1μm 的大腸桿菌 。
我們根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型的直徑大小，第一步要確認(rèn)合適的物鏡放大倍數(shù)，就跟在顯微鏡下有4X、10X、40X和100X不同放大倍數(shù)一樣，需要選擇一個(gè)正確的物鏡來(lái)滿(mǎn)足成像清晰和識(shí)別。正常的細(xì)胞系和原代細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用5X物鏡光學(xué)放大就可滿(mǎn)足，針對(duì)酵母和球藻以及一些粒徑更小的微生物樣本，需要用到10X甚至20X物鏡才能夠看的清晰。
2、細(xì)胞分析是關(guān)注細(xì)胞活率還只是細(xì)胞濃度？
細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分為明場(chǎng)款（激發(fā)光為白光）和熒光款（不同顏色的激發(fā)光），其中明場(chǎng)包括非臺(tái)盼藍(lán)染色和臺(tái)盼藍(lán)染色，如果您平時(shí)只關(guān)注細(xì)胞濃度，這時(shí)選一款明場(chǎng)計(jì)數(shù)儀即可滿(mǎn)足需求。那如果細(xì)胞濃度和細(xì)胞活率都關(guān)注，我們就需要考慮用經(jīng)典臺(tái)盼藍(lán)染色還是AO（吖啶橙）/PI（碘化丙啶）雙熒光染色分析。
臺(tái)盼藍(lán)和熒光染色比較
臺(tái)盼藍(lán)染色 | AO/PI熒光染色 | |
原理 | 細(xì)胞膜的通透性 （非特異性染色） | 核酸染色 （特異性染色） |
識(shí)別區(qū)分 | 活細(xì)胞：不染色 死細(xì)胞：藍(lán)色 | 活細(xì)胞：綠熒光 死細(xì)胞：紅熒光 |
適用范圍 | 常規(guī)傳代培養(yǎng)細(xì)胞 | 細(xì)胞系、原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞等 |
當(dāng)然，除了臺(tái)盼藍(lán)和AO/PI雙熒光染色之外，還可以通過(guò)AO/DAPI染色，DAPI染色可以標(biāo)記所有細(xì)胞核，可能在特定條件下染色死細(xì)胞。PI相比DAPI染死細(xì)胞則更為專(zhuān)一，用于標(biāo)記失去膜完整性的死細(xì)胞。針對(duì)細(xì)菌的活率分析，還可以通過(guò)SYTO-9/PI染色，SYTO-9是一種能夠透過(guò)細(xì)胞膜的綠色熒光核酸染料，可用于細(xì)菌的RNA和DNA染色。
2、測(cè)試數(shù)據(jù)的可靠性
在完成第一步選擇后，接下來(lái)需要選擇一個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠的計(jì)數(shù)儀，無(wú)論它功能多么強(qiáng)大，數(shù)據(jù)可靠性是關(guān)鍵的，它主要體現(xiàn)在測(cè)試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
其中準(zhǔn)確性是測(cè)試值與真實(shí)值之間的差異，我們一方面可以通過(guò)與人工血球計(jì)數(shù)對(duì)比，相同的一管細(xì)胞樣本，通常要求計(jì)數(shù)儀與人工之間的計(jì)數(shù)誤差在10%以?xún)?nèi)；另一方面可以用標(biāo)準(zhǔn)品（不同濃度、直徑和活率的標(biāo)準(zhǔn)品）進(jìn)行驗(yàn)證；要求更高的用戶(hù)會(huì)請(qǐng)第三方計(jì)量公司進(jìn)行再次計(jì)量驗(yàn)證，最后結(jié)合自己的細(xì)胞進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，通過(guò)以上多重驗(yàn)證，最后確定儀器的準(zhǔn)確性 。
其次，穩(wěn)定性通常我們可以對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行幾組平行測(cè)試，或者對(duì)同一個(gè)高濃度樣品做梯度稀釋分析線(xiàn)性關(guān)系，這里面有一個(gè)重要的參數(shù)CV值（變異系數(shù)），一個(gè)可靠的計(jì)數(shù)儀，在合適的濃度范圍內(nèi)，通常CV值＜5%。
決定一個(gè)計(jì)數(shù)儀數(shù)據(jù)可靠性，主要有以下兩個(gè)方面：
硬件 包括光路系統(tǒng)、成像系統(tǒng)，其中成像的像素決定圖片的清晰度，從而影響到識(shí)別結(jié)果；配置越高，成像越清晰；其次是自動(dòng)化過(guò)程，這里面包括進(jìn)樣、對(duì)焦、曝光等參數(shù)，全自動(dòng)過(guò)程能減少人為操作帶來(lái)的誤差，從而提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，
軟件算法 在獲得一張高質(zhì)量圖片之后，要對(duì)其進(jìn)行算法識(shí)別分析，目前主要基于兩種算法，一種是基于灰度值（普通算法），另外一種是基于深度學(xué)習(xí)人工智能算法（AI算法），這種先進(jìn)算法相對(duì)于普通算法，能夠?qū)蹐F(tuán)細(xì)胞精準(zhǔn)分割，對(duì)不規(guī)則細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別，對(duì)含有細(xì)胞碎片、雜質(zhì)等復(fù)雜樣本精確計(jì)數(shù)，這種算法能夠?qū)崿F(xiàn)不同領(lǐng)域、不用應(yīng)用場(chǎng)景的計(jì)數(shù)分析。萌薇生物也是國(guó)內(nèi)早期將AI技術(shù)應(yīng)用在細(xì)胞計(jì)數(shù)領(lǐng)域并進(jìn)行儀器開(kāi)發(fā)的廠(chǎng)家。
3、檢測(cè)效率
傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)法能夠不斷被智能細(xì)胞計(jì)數(shù)儀替代，其中檢測(cè)效率是一個(gè)非常大的因素，如果您每天檢測(cè)的細(xì)胞樣本量多，檢測(cè)效率相當(dāng)關(guān)鍵，一個(gè)優(yōu)秀的計(jì)數(shù)儀，不僅準(zhǔn)和穩(wěn)，快也很重要。檢測(cè)效率主要包括以下兩點(diǎn)：
單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間：通常檢測(cè)一個(gè)樣品，人工計(jì)數(shù)時(shí)間在3-5分鐘，計(jì)數(shù)儀在10秒到2分鐘時(shí)間不等，產(chǎn)生差異的原因主要是儀器的自動(dòng)化程度，尤其是手動(dòng)進(jìn)樣和手動(dòng)調(diào)焦會(huì)直接影響到計(jì)數(shù)的效率，其次是算法分析的時(shí)間也有差異，例如先進(jìn)的AI算法將直接縮短處理圖片的時(shí)間，這也是為什么萌薇計(jì)數(shù)儀實(shí)現(xiàn)測(cè)試分析速度快的重要原因。
計(jì)數(shù)板通量：一塊血球計(jì)數(shù)板有兩個(gè)加樣孔槽，市面上絕大數(shù)計(jì)數(shù)儀也是采用兩個(gè)通量，當(dāng)我們樣本量比較多時(shí)，就需要更高通量的計(jì)數(shù)板，一次性可以同時(shí)測(cè)多少樣品，這也是決定效率的一個(gè)因素。
4、其他因素
除了以上三點(diǎn)以外，還有一些其他因素也得考慮：
機(jī)型--分體機(jī)還是一體機(jī)，主要根據(jù)細(xì)胞房空間大小來(lái)選擇，分體機(jī)需要連接電腦，一體機(jī)則包含顯示屏，可直接操作，相對(duì)分體機(jī)價(jià)格要高一些，但使用起來(lái)簡(jiǎn)單方便。
軟件分析功能--一臺(tái)優(yōu)秀的計(jì)數(shù)儀在完成基本的參數(shù)（細(xì)胞濃度、活率、直徑、圓度、聚團(tuán)率）分析功能之后，還要具備對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)的整理和分析，包括直徑分布圖、測(cè)試數(shù)據(jù)再分析、數(shù)據(jù)對(duì)比分析（CV值計(jì)算）、增殖曲線(xiàn)等分析功能；滿(mǎn)足JPG、EXCEL、PDF等多種格式的數(shù)據(jù)輸出方式，不僅能通過(guò)U盤(pán)輸出還可以通過(guò)服務(wù)器輸出；數(shù)據(jù)的備份和恢復(fù)也是必要的，保障用戶(hù)的數(shù)據(jù)；除此之外，稀釋計(jì)算器和傳代計(jì)算器會(huì)讓您的實(shí)驗(yàn)變得更加簡(jiǎn)單。
性?xún)r(jià)比--硬件配置高，軟件分析功能強(qiáng)大，技術(shù)參數(shù)優(yōu)秀的計(jì)數(shù)儀往往相比于低配置的參數(shù)價(jià)格高一些，但不能一味追求低價(jià)，讓數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和精確性沒(méi)了保障，甚至反而影響我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，最后可能面臨重新選擇。所有小薇經(jīng)常在一些用戶(hù)細(xì)胞房會(huì)發(fā)現(xiàn)在吃灰的低端計(jì)數(shù)儀，面對(duì)這些價(jià)格低的儀器選擇要慎重！
服務(wù)--這里包括售前售后服務(wù)、試用培訓(xùn)、技術(shù)支持，3Q驗(yàn)證服務(wù)，以及儀器的質(zhì)保期。
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