在開發(fā)特定細胞系的培養(yǎng)條件時需要考慮許多參數(shù)。我們都知道 pH 平衡、氧氣水平和血清濃度是影響培養(yǎng)成敗的重要變量。然而，包括與細胞需求相匹配的解離方法的傳代方案也同樣重要?？紤]到這一點，我們將回顧一些常見解離實踐背后的原則，以幫助您根據(jù)細胞系的具體性質(zhì)定制方法。

懸浮生長的細胞易于傳代培養(yǎng)。只要在細胞耗盡營養(yǎng)供應(yīng)之前將細胞稀釋到合適的新鮮培養(yǎng)基中，它們就會表現(xiàn)得很好。另一方面，單層生長的細胞彼此之間以及與培養(yǎng)皿之間形成蛋白質(zhì)接觸。在將細胞懸浮在培養(yǎng)基中、離心并重新鋪板之前，必須先將這些物質(zhì)破壞。因此，必須特別考慮以確保解離條件破壞細胞接觸而不殺死細胞。

胰蛋白酶有時（但并非總是）是答案

在決定解離條件時，研究者應(yīng)考慮細胞形成的鍵的類型。一些貼壁細胞系僅形成微弱的接觸，只需將培養(yǎng)瓶敲擊手掌或?qū)⑴囵B(yǎng)瓶敲擊臺面即可破壞接觸。其他貼壁細胞系，特別是那些源自上皮的細胞系，會形成牢固的多蛋白緊密連接，只能通過酶消化來破壞；在這些情況下，通常使用胰蛋白酶（一種絲氨酸蛋白酶）。源自上皮的細胞還可以表達鈣粘蛋白，其介導(dǎo)非常強的鈣依賴性粘附或橋粒連接。在這種情況下，可能需要添加鈣螯合劑（如 EDTA）來隔離鈣，以有效地解離細胞。

優(yōu)化解離后的活力

為了優(yōu)化解離后的細胞活力，反應(yīng)條件應(yīng)與細胞接觸的強度相匹配。例如，如果標準胰蛋白酶/EDTA 消化（通常為 0.05%-0.5%）不能有效消化細胞鍵（10-15 分鐘內(nèi)），則可能很難在細胞開始死亡之前將其從平板上移除，并且細胞活力也會受到影響。將會受到不利影響。在這種情況下，可能需要更高濃度的胰蛋白酶/EDTA 或其他酶，例如膠原酶。另一方面，如果反應(yīng)過于劇烈，細胞可能會裂解或失去重新附著到平板上所需的表面蛋白，這兩種情況都會導(dǎo)致活力降低。此外，裂解的細胞會釋放基因組 DNA，導(dǎo)致活細胞聚集，使存活細胞更難重新鋪板，因此需要添加 DNase。

準備是良好解離的關(guān)鍵

如果您已將反應(yīng)強度與細胞系的粘附特性相匹配，但您的細胞仍然難以去除，您可能會發(fā)現(xiàn)問題在于細胞準備解離的方式。生長培養(yǎng)基中可能存在抑制胰蛋白酶的成分，例如血清，但這可以通過簡單地用Dulbecco PBS沖洗細胞一到兩次來克服 （不含鈣或鎂）在添加解離試劑之前。也可能是細胞保持匯合的時間太長。在這些條件下，細胞可能會形成異常牢固的細胞-細胞和細胞-表面連接，并且異常難以破壞。出于這個原因，以及為了培養(yǎng)物的整體健康，建議細胞在達到 100% 匯合（即 70-90% 匯合）之前進行傳代。

結(jié)論

有了對解離試劑如何工作的基本了解，研究人員可以開發(fā)一種優(yōu)化的方案，同時考慮細胞粘附特性的強度和質(zhì)量。細胞解離的優(yōu)化方案將確保成功傳代并延長細胞在培養(yǎng)物中的壽命。